大咖講堂 | 相干拉曼散射顯微術(shù) Ⅱ

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上節(jié)我們講到——相干拉曼散射（CRS）顯微術(shù)是一種基于分子化學(xué)鍵振動的成像手段。相比于熒光光譜，拉曼光譜具有窄得多的譜峰寬度（圖 1），可以選擇探測的分子種類將更多，特異性也更高。例如，生物組織中的蛋白、脂質(zhì)和核酸等具有各自的拉曼光譜特征，利用 CRS 可以在無需染色/標(biāo)記的前提下對它們進(jìn)行區(qū)分成像。

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但脫離應(yīng)用的理論就像浩渺星海中失去坐標(biāo)的飛船，空得一身高強(qiáng)本領(lǐng)卻無處發(fā)揮。因此，秉承上節(jié)所述的相干拉曼顯微術(shù)的基本原理，本小節(jié)將圍繞快速病理檢測、生物代謝和藥物運(yùn)輸三個典型方面詳細(xì)展開免標(biāo)記相干拉曼顯微術(shù)的應(yīng)用，為這艘“神州飛船”的前行指引明燈。

▲圖 1. 常見生物組分和分子的拉曼光譜

快速病理檢測：

病理檢測是疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有的病理檢測方法需要經(jīng)過活檢（或手術(shù)）取樣、固定、切片、染色等一系列繁雜過程，往往耗時幾天，無法實現(xiàn)術(shù)中實時診斷。術(shù)中冰凍往往也至少需要半個小時，而且診斷準(zhǔn)確率不高?；谏锝M織內(nèi)源性光學(xué)信號的成像方法有望快速提供組織病理學(xué)信息，輔助術(shù)中診斷。

2013 年，季敏標(biāo)教授在哈佛大學(xué)謝曉亮教授課題組學(xué)習(xí)期間利用 SRS 顯微鏡實現(xiàn)了在腦膠質(zhì)瘤小鼠模型活體中原位實時地探測腫瘤邊界^[1]，之后在離體人腦腫瘤手術(shù)標(biāo)本中實現(xiàn)無標(biāo)記病理診斷^[2]。歸國后，季教授課題組在復(fù)旦大學(xué)搭建了結(jié)合了 SRS、SHG 和 TPEF 的多模態(tài)非線性光學(xué)成像系統(tǒng)，可同時獲取脂質(zhì)、蛋白、膠原纖維三個通道的圖像。在近期一篇文章中，季教授不僅在喉癌組織切片層面展示了 SRS 和傳統(tǒng)病理 HE 染色的高度一致性（圖 2），并且通過對喉癌術(shù)中新鮮組織的成像，累計了數(shù)萬份圖像數(shù)據(jù)，后基于搭建的 34 層殘差卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ResNet34）進(jìn)行圖像訓(xùn)練識別，獲得了近乎 100%準(zhǔn)確率的腫瘤與正常組織的鑒別效果^[3] 。

由于 SRS 繼承了自發(fā)拉曼的光譜特性，使其能夠在高光譜掃描時得到重要的譜學(xué)信息。在對阿爾茲海默（AD）研究的過程中^[4] ，發(fā)現(xiàn)錯誤折疊的淀粉樣蛋白會因為 β-sheet 的富集而導(dǎo)致 amide I 的拉曼峰藍(lán)移（峰位從 1658 cm^-1變?yōu)?1670 cm^-1）；并且通過對新鮮 AD 鼠腦組織成像，觀察到了每個 Aβ 斑塊的周圍都會有一圈“Halo”的特殊構(gòu)象（圖 3），這是熒光研究（只能對確定物質(zhì)進(jìn)行特異性染色）所難以發(fā)現(xiàn)的，充分體現(xiàn)了 SRS 在病理學(xué)檢測上的*優(yōu)勢。

▲圖 2. SRS 與 HE 圖像的一致性對比（綠：脂質(zhì)；藍(lán)：蛋白質(zhì)；紅：膠原纖維）[3]

▲圖 3. 新鮮 AD 鼠腦的 SRS 光譜圖像以及斑塊、正常組織的光譜差異 [4]。（a-c）指紋區(qū)的光譜圖像，綠：脂質(zhì)；藍(lán)：正常蛋白質(zhì)；洋紅：淀粉樣蛋白斑塊。（d-f）C-H 伸縮振動區(qū)的光譜圖像，綠：脂質(zhì)；洋紅：總蛋白質(zhì)。(g-h)不同組織區(qū)域的 SRS 光譜

生物代謝：

以高時空分辨率直接觀察活體動物的代謝動力學(xué)對理解許多生物學(xué)過程至關(guān)重要。脂類分子是重要的生命組成物質(zhì)，但定量地觀察其空間分布一直是一個難題。使用熒光基團(tuán)時，有可能產(chǎn)生假象，做出的判斷有偏差。相比之下，SRS 可以對分子直接可視化，得到的結(jié)果具有普遍意義。

2018 年，哥倫比亞大學(xué)閔瑋教授課題組發(fā)展了將重水（D2O）代謝與受激拉曼散射（DO-SRS）顯微技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，用于原位代謝觀測^[5] 。在生物代謝過程中，經(jīng)過酶的催化合成，D2O 中的氘原子會被自動整合到有機(jī)分子中，形成同位素標(biāo)記的 C-D 鍵。因此，基于對新合成有機(jī)分子中 C-D 鍵的成像，就可以實現(xiàn)生物代謝的追蹤觀測（視頻 1）。目前，在 C-D 鍵的廣泛振動光譜中，他們發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的特異性拉曼位移，并開發(fā)了光譜解調(diào)方法來獲得具有大分子選擇性的 C-D 信號，做到了在動物模型中脂質(zhì)、蛋白甚至糖類的代謝測量^[6][7]。 

▲視頻 1.秀麗隱桿線蟲的脂質(zhì) SRS 實時成像（左：原本存在的脂質(zhì)；右：利用 D2O 新合成氘代脂質(zhì)）[5]

藥物運(yùn)輸：

在醫(yī)藥學(xué)中，藥物的運(yùn)輸是學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)之一，準(zhǔn)確地運(yùn)輸過程及定位，是藥物分子能實現(xiàn)特定生理功能的重要保障。制作小分子藥物的熒光標(biāo)簽并非容易之事，常用的熒光標(biāo)簽往往比藥物分子大很多，這會影響他們的運(yùn)輸特性；因此，利用傳統(tǒng)熒光標(biāo)記方法追蹤小分子藥物面臨很多挑戰(zhàn)。而很多藥物分子本身具有特殊的化學(xué)鍵振動（圖 4），因此，利用 SRS 可以對該藥物進(jìn)行很好的特異性成像，加之 SRS 不需要對樣品固定、染色等操作，保持了生物體樣品的活性，可以實現(xiàn)系列活體動態(tài)捕捉。

2014 年，閔瑋教授將療霉舒乳膏涂抹于小鼠耳朵部位，通過對藥膏中鹽酸特比萘芬分子的炔基進(jìn)行特異性成像，結(jié)合脂質(zhì)和蛋白通道的共定位，發(fā)現(xiàn)了該藥物是通過皮膚中脂質(zhì)進(jìn)行滲透的^[8]（圖 5）。

同年，謝曉亮教授課題組報道了利用高光譜受激拉曼散射（hsSRS）成像技術(shù)對兩種酪氨酸激酶抑制劑（TKI）藥物（伊馬替尼和尼洛替尼）在活細(xì)胞內(nèi)的免標(biāo)記成像以及定量分析^[9] 。他們發(fā)現(xiàn)，由于這兩種藥物具有溶酶體的親溶性，它們在溶酶體中的濃度都增加了 1000 倍以上。當(dāng)同時使用氯喹時，伊馬替尼的溶酶體捕獲減少了十倍以上，這表明氯喹除了常見的自噬抑制機(jī)制外，還可能通過溶酶體介導(dǎo)的藥物相互作用提高 TKIs 的療效。

▲圖 4. 藥物分子的結(jié)構(gòu)式及其拉曼光譜 [9]

▲圖 5.局部應(yīng)用鹽酸特比萘芬對小鼠耳部皮膚的 SRS 成像（2230cm^-1：鹽酸特比萘芬；1655cm^-1：蛋白質(zhì)；脂質(zhì) 2845cm^-1：脂質(zhì)）[8]

下一節(jié)我們還將聚焦 CRS 發(fā)展前沿，介紹 CRS 技術(shù)的新進(jìn)展。