利用徠卡LMD研究冠狀病毒對(duì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路和染色質(zhì)分布的影響

冠狀病毒因?yàn)榘ど厦懿贾愃迫彰岬募欢妹?，屬于冠狀病毒科，正冠狀病毒亞科的冠狀病毒屬。根?jù)血清學(xué)和基因組學(xué)特點(diǎn)，該屬名代表了α、β、γ和δ四個(gè)屬。目前已知感染人的冠狀病毒包括7種，即α屬的普通冠狀病毒HCoV?229E和HCoV?OC43，β屬的HCoV?NL63、HCoV?HKU1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）-CoV和中東呼吸綜合征（MERS）-CoV，以及此次導(dǎo)致武漢不明原因肺炎的2019-nCoV。其中，HCoV?HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV可以導(dǎo)致人類肺炎，其他是成人普通感冒的病原，兒童較敏感，可致上呼吸道感染。

早在2008年的《Cell》中，一組來(lái)自日本科學(xué)家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色，而另一種使得S/G2/M期細(xì)胞核呈現(xiàn)出綠色，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細(xì)胞周期標(biāo)志物（Fucci）。

 
早在2008年的《Cell》中，一組來(lái)自日本科學(xué)家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色，而另一種使得S/G2/M期細(xì)胞核呈現(xiàn)出綠色，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細(xì)胞周期標(biāo)志物（Fucci）。

圖1 Cell封面圖片：處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞核發(fā)出紅色或綠色熒光


圖2 LMD-切割細(xì)胞的典型周期狀態(tài)
 

利用這一發(fā)現(xiàn)，來(lái)自德國(guó)吉森大學(xué)藥理學(xué)的Poppe與他的合作者們研究了冠狀病毒對(duì)細(xì)胞NF-κB通路和染色質(zhì)分布的影響。
 
研究人員首先用HCoV-229E感染A549肺癌細(xì)胞模型，然后通過(guò)激光顯微切割（LMD6000）結(jié)合免疫熒光用于分解（i）被HCoV-229E感染的細(xì)胞，（ii）與感染細(xì)胞緊鄰的細(xì)胞，（iii）距離感染細(xì)胞至少150μm的細(xì)胞（“遠(yuǎn)端細(xì)胞”）和（iv）單獨(dú)的未感染的細(xì)胞。

圖3 細(xì)胞株示意圖

他們分離了表達(dá)冠狀病毒N蛋白的細(xì)胞，并提取了整個(gè)RNA。

圖4 借助免疫熒光和激光顯微切割分離細(xì)胞株

Laser microdissection實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

• 細(xì)胞接種在加入2μm 青霉素（PEN）的30mm的圓形培養(yǎng)皿中。
• 免疫染色和LMD按照預(yù)定方案*進(jìn)行，并進(jìn)行如下修改。
• 處理結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌2次，每次5分鐘，并用2ml乙醇固定5分鐘。
• 在HBSS中洗滌30秒，然后用2ml HBSS /0.1% Saponin加10%驢血清封閉，孵育3分鐘。
• 稀釋1:50的N蛋白抗體或1:400的P(S2)-pol II，在含0.1%皂素的400μm Hank’s BSS中37℃孵育。
• 用Hank’s BSS/0.1%皂素洗滌30秒。
• 用y3抗體(1:50)和Dylight488二抗(1:400)，室溫400μl HBSS/0.1% Saponin。
• 在2 ml HBSS中洗滌3次，每次30秒，然后在2ml DEPC水中洗滌30次，然后在40℃干燥30分鐘。
• 使用Leica LMD6000系統(tǒng)將未感染的細(xì)胞和感染的細(xì)胞切除并收集在微量離心管中，用熒光顯微鏡檢測(cè)。

 
Leica激光顯微切割系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)

• 從病理樣本、細(xì)胞樣本或涂片中，采用激光切割、分離收集特定染色體，細(xì)胞，組織，從而進(jìn)行細(xì)胞的下游基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、或代謝組水平的分析及驗(yàn)證。
• 可應(yīng)用于特定的單個(gè)染色體、細(xì)胞、整個(gè)組織區(qū)域，甚至骨骼、牙齒、大腦、植物等的切割分離。重力非接觸收集模式（Patent No.：DE10057292, EP1207392, JP3641454）清晰、無(wú)污染?？膳鋫渥詣?dòng)高通量切割及收集模式。操作過(guò)程中無(wú)需移動(dòng)樣品，而是通過(guò)專激光光束任意掃描切割（Patent No.：EP1276586、US7035004、JP3996773），操作靈活、便捷清晰干凈。重力收集模式又很好地避免了樣品污染。
• 采用*的激光設(shè)計(jì)和易用的動(dòng)態(tài)軟件，高達(dá)5000 Hz脈沖的349nm，干凈、高效的切割目標(biāo)物邊緣，而目標(biāo)物體無(wú)需接觸激光，不受影響。
• 采用普通的0.2或0.5ml離心管即可收集，耗材成本低。

圖5 LMD切割示意圖

接著，研究人員通過(guò)利用RT-qPCR和微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與感染細(xì)胞緊鄰的細(xì)胞在單細(xì)胞水平上表征與存在于相同或不同培養(yǎng)物中的相鄰的未感染細(xì)胞相反，感染后的基因表達(dá)發(fā)生了變化。并通過(guò)HCoV-229E病毒N蛋白的免疫熒光（DMIRE2，DMi8）分析來(lái)監(jiān)測(cè)HCoV-229E感染并在A549細(xì)胞中擴(kuò)散。
 
病毒學(xué)中熒光顯微鏡可以更好地滿足研究人員的需求。然而，在對(duì)動(dòng)物組織進(jìn)行研究時(shí)，仍有機(jī)會(huì)進(jìn)行明場(chǎng)顯微鏡檢查，比如檢查病毒感染后組織的形態(tài)變化等。
 
此外，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中使用明視野顯微鏡檢查已經(jīng)感染或?qū)?huì)感染的細(xì)胞（DM IL，DMi1，PAULA）的健康狀況和生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖6 極化上皮細(xì)胞MDCK的明場(chǎng)圖像

Leica顯微鏡在病毒學(xué)中的應(yīng)用遠(yuǎn)不止這些，而這些看似基礎(chǔ)的研究工作恰恰起到了直接作用。另外還有其他用于病毒可視化的技術(shù)，例如電子顯微鏡(EM)可以分解病毒顆粒、單分子檢測(cè)(TCS SP8 SMD)、熒光壽命成像(FLIM) (STELLARIS 8 FALCON)以及多光子顯微鏡(SP8 DIVE)是適用于病毒學(xué)的其他方法，這些今后為您介紹。

參考文獻(xiàn)：
[1] Chin J Prev Med, March 2020, Vol.54, No.3
[2] Nat Rev Microbiol. 2013;11(12):836–48. pmid:24217413
[3] Mol Cell. 2014;53(2):193–208.
[4] Cell, Vol 132, 487-498, 08 February 2008
* Am  J  Pathol.  1999;154(1):61-6.