如何實(shí)現(xiàn)快速、穩(wěn)定的多色活細(xì)胞成像

MICA如何幫助用戶研究活細(xì)胞和動(dòng)物

研究人員在活細(xì)胞成像技術(shù)的幫助下，可以深入了解活細(xì)胞甚至完整生物體的動(dòng)態(tài)過程，這包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外活動(dòng)。一些代表性的示例包括蛋白質(zhì)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫細(xì)胞遷移，類器官的細(xì)胞組織等?；罴?xì)胞成像要求樣本和顯微鏡系統(tǒng)具備特定的屬性。在這篇文章中，我們描述了MICA對這些先決條件的具體調(diào)整，并提供了合適的示例。

活細(xì)胞成像

活細(xì)胞成像在微觀層面揭示了生物過程的信息。它要求將標(biāo)本保存在接近生理的條件下。下一段介紹了部分條件。典型的樣本包括細(xì)胞培養(yǎng)物、活組織、類器官或模式生物，通常使用熒光顯微鏡研究這類樣本。為此需要轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而產(chǎn)生表達(dá)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因體。此外，還可以使用活細(xì)胞染料。

挑戰(zhàn)

環(huán)境條件：

為盡可能獲得接近真實(shí)狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，活細(xì)胞成像條件必須模擬生理環(huán)境。不同的生物體所需的生理?xiàng)l件也不同，包括溫度、pH、氧氣含量等。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞要求的溫度是37°C左右，昆蟲細(xì)胞的最佳溫度是27°C，魚為28°C，而裂殖酵母則為30°C左右。

在碳酸氫鈉緩沖液的幫助下，細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的pH值持續(xù)保持在7.0-7.4，這就要求培養(yǎng)箱環(huán)境中相應(yīng)地存在二氧化碳。此外，培養(yǎng)箱的環(huán)境應(yīng)該是水飽和的，這樣就不會(huì)有培養(yǎng)基蒸發(fā)了。

體內(nèi)不同組織和細(xì)胞類型的氧含量不同。有趣的是，目前細(xì)胞培養(yǎng)箱和活細(xì)胞成像并沒有廣泛考慮氧的問題。不理想的氧氣水平會(huì)導(dǎo)致增殖率下降（高氧）或代謝率降低（低氧）（Hadanny, A.; Efrati, S.）。

光保護(hù)是活細(xì)胞成像的另一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)楣庹丈淇梢杂绊懟罴?xì)胞本身以及熒光團(tuán)。例如，強(qiáng)光可以導(dǎo)致DNA損傷或光漂白熒光團(tuán)。

MICA的設(shè)計(jì)旨在應(yīng)對所有這些挑戰(zhàn)：

外殼本身就像一個(gè)培養(yǎng)箱。這意味著樣本周圍空間被加熱到所需的溫度（比室溫高5°C，最高42°C），并平衡到所需的二氧化碳濃度和濕度。

如果需要的話，氧氣濃度可以在一個(gè)額外的載物臺(tái)頂部腔室中控制。所有的參數(shù)均可通過MICA LAS X軟件控制。樣本的曝光由OneTouch功能設(shè)置，并可通過“樣本保護(hù)-圖像質(zhì)量"滑塊進(jìn)行調(diào)整，以平衡所需的信號量與保護(hù)活細(xì)胞和熒光團(tuán)。

為了在最小的環(huán)境干擾下獲取樣本，在前門中隱藏有一個(gè)小的服務(wù)擋板。

圖1：MICA是一個(gè)培養(yǎng)箱。蓋子下面的整個(gè)空間被平衡到所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度。為了快速檢查樣本或操作，前蓋可以折疊下來，一個(gè)小的服務(wù)擋板可以滑開。

光可能是有毒的

由于光是帶入樣本的能量，它可能有負(fù)面的影響。任何光都可能干擾細(xì)胞內(nèi)的分子，例如紫外線可能傷害皮膚。此外，熒光團(tuán)可能形成與分子相互作用的自由基。光的負(fù)面作用被稱為光毒性。挑戰(zhàn)在于能產(chǎn)生足夠的信號來解答科學(xué)問題的足夠光量與盡量減少光毒性的平衡。MICA通過提供一個(gè)工具來幫助用戶在不需要了解技術(shù)背景的情況下精確地平衡這兩件事——保護(hù)-質(zhì)量滑塊。只需點(diǎn)擊一下，OneTouch將根據(jù)滑塊上的選擇設(shè)置所有的激發(fā)和檢測參數(shù)。

細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化可能非常快。例如，攜帶細(xì)胞器或囊泡的分子速度可達(dá)幾微米/秒（Alberts B.等人）。這影響了對圖像采集的要求，特別是當(dāng)需要對多個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行成像時(shí)。這里的問題是，生物不會(huì)暫停所有的熒光通道從而在相同的狀態(tài)下進(jìn)行采集，而是持續(xù)不斷進(jìn)行。在一個(gè)經(jīng)典的基于熒光過濾器的系統(tǒng)中，通常最耗時(shí)的步驟是為不同的通道更換濾光片。這導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)熒光團(tuán)在兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)被監(jiān)測，導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)精確的時(shí)空相關(guān)性。

MICA FluoSync™技術(shù)使用戶能夠同時(shí)獲得多達(dá)四個(gè)熒光通道。這意味著不同的囊泡、細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)蛋白可以以100%的時(shí)空相關(guān)性進(jìn)行成像。此外，同步采集使成像時(shí)間點(diǎn)的節(jié)奏更快，因此，可以用更靈敏地記錄快速的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

在給定的時(shí)間范圍內(nèi)記錄許多重復(fù)的情況

在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中記錄許多次重復(fù)可能是一個(gè)挑戰(zhàn)。假設(shè)用戶想每10分鐘記錄一次，那么在下一個(gè)周期開始之前，只能記錄一定數(shù)量的位置。通常情況下，如果您想在同一位置記錄多個(gè)標(biāo)簽，就會(huì)有更多限制，但MICA不存在這個(gè)問題。FluoSync™技術(shù)使用戶能夠以四倍的速度記錄，因?yàn)樗疃嗫梢酝瑫r(shí)獲取四個(gè)標(biāo)簽，從而為用戶留下更多的時(shí)間來記錄更多位置。用戶不必再在標(biāo)簽數(shù)量和位置之間進(jìn)行權(quán)衡。

尋找正確的位置進(jìn)行成像

在樣本的正確位置上尋找和設(shè)置實(shí)驗(yàn)是具有挑戰(zhàn)性的。實(shí)驗(yàn)人員需要使用目鏡了解樣本的整體概況，并記住不同的位置。數(shù)字顯微鏡可以生成樣本的預(yù)覽，這可以提供一些幫助，但實(shí)驗(yàn)人員仍然需要指出圖像中要進(jìn)一步成像的位置。MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低放大倍數(shù)或高放大倍數(shù)的預(yù)覽，輕松定位感興趣的區(qū)域，這些感興趣區(qū)域可以用工具直接在圖像上標(biāo)記出。通過這種方式，后續(xù)高分辨率的圖像可以保存下來。

選擇正確的活細(xì)胞成像物鏡

由于活細(xì)胞成像通常是在水溶液中進(jìn)行的，高倍率物鏡使用水作為浸沒介質(zhì)，因?yàn)樗c培養(yǎng)基介質(zhì)的光學(xué)特性相匹配。將水放在物鏡和樣品之間是很麻煩的，而且會(huì)導(dǎo)致樣本的焦點(diǎn)和位置的改變。此外，水蒸發(fā)得相當(dāng)快，因此需要不斷補(bǔ)充。MICA集反饋回路于一體，在水浸式物鏡的整個(gè)使用過程中，首先建立并維持浸沒狀態(tài)。這種方法不需要手動(dòng)操作，可以進(jìn)行長期實(shí)驗(yàn)。

為進(jìn)一步提高光學(xué)質(zhì)量，一些物鏡會(huì)通過校正環(huán)來補(bǔ)償樣本平板的厚度。校正環(huán)可手動(dòng)、也可自動(dòng)操作。MICA配置了自動(dòng)校正環(huán)功能，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)優(yōu)化。

重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間的可比性

科學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)關(guān)鍵方面是，盡可能少的變更可變參數(shù)以實(shí)現(xiàn)對樣品和結(jié)果影響的把控。這包括在所有的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用同一套成像條件。一個(gè)方面是穩(wěn)定的環(huán)境條件（溫度、pH值和O2，也見上文）。另一個(gè)重要方面是相同的成像參數(shù)（激發(fā)和檢測）。MICA默認(rèn)在不同項(xiàng)目中保持成像參數(shù)不變，用戶僅基于自己的需求進(jìn)行調(diào)整?？筛鶕?jù)參考圖像恢復(fù)成像參數(shù)。在環(huán)境條件方面，MICA是一個(gè)培養(yǎng)箱。MICA條件穩(wěn)定能允許MDCK囊腫連續(xù)生長3周（也見下文）。

方法

Mica有用于活細(xì)胞成像的特殊的樣本架。這包括用于小型（36毫米）和中型（60毫米）培養(yǎng)皿的支架。

圖2：活細(xì)胞成像樣本架。有適用于不同尺寸的培養(yǎng)皿的支架?；罴?xì)胞成像也可以使用經(jīng)典的載玻片支架（未顯示），例如，使用ibidi µ-Slide 8 Well載玻片支架。

囊泡:

U2OS細(xì)胞同時(shí)用WGA-Alexa488和WGA-Alexa555進(jìn)行染色。這兩種染料都聚集在細(xì)胞的質(zhì)膜和所有囊泡和內(nèi)體上。熒光劑同時(shí)或序列成像以進(jìn)行比較。環(huán)境被設(shè)定為37℃恒溫和5%CO₂，即生理pH水平。

對于高倍率成像，使用了帶有自動(dòng)加水功能的63x/1.20水鏡。不需要人工操作。

斑馬魚:

圖像中的魚（斑馬魚）是一個(gè)帶有中胚層命運(yùn)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因魚（Tbxta：GFP）。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)發(fā)育中的胚胎從球期到體期被成像。用Dextran-Alexa647標(biāo)記間質(zhì)。胚胎保持在28℃。

囊腫：

a)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了EB1-GFP的MDCK細(xì)胞在基質(zhì)Matrigel中培養(yǎng)，在ibidi µ-Slide 8 Well玻片上誘導(dǎo)囊腫生長。環(huán)境被設(shè)定為保持恒定的37℃，5%的二氧化碳和高濕度。

在第2天，細(xì)胞已經(jīng)顯示出三維聚團(tuán)，并在基質(zhì)Matrigel內(nèi)高度流動(dòng)。

在第9天，囊腫保持相對穩(wěn)定的位置，用較高的放大率（63倍）進(jìn)行成像并在穩(wěn)定狀態(tài)下和隨著時(shí)間的推移（6天和6小時(shí)的時(shí)間間隔的GFP和IMC（明場成像的調(diào)制對比））。三維采集能獲得囊腫的三維圖像（418層，220.7納米間距，總Z-Stack大小92.02微米）。在第9天，一些囊腫除了EB1-GFP之外，還被Mito-Blue、SiR-Actin和Tubulin-SPY555標(biāo)記。

b)5000個(gè)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了EB1-GFP的MDCK細(xì)胞在U型孔板中生長。有趣的是，這些細(xì)胞在幾天后也形成了囊狀結(jié)構(gòu)。其中一個(gè)囊狀結(jié)構(gòu)在共聚焦模式下被進(jìn)一步研究，以進(jìn)行三維重建。

結(jié)果
短期的快速事件實(shí)驗(yàn)

U2OS細(xì)胞用兩種不同的熒光染料標(biāo)記相同的結(jié)構(gòu)，WGA-Alexa488和WGA-Alexa555，它們都與細(xì)胞膜結(jié)合。通過在MICA序列模式下獲取兩個(gè)通道的這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置能夠在獲取WGA-Alexa488（綠色）和WGA-Alexa555（紅色）之間引入一個(gè)人為的時(shí)間差。有了這種實(shí)驗(yàn)設(shè)置，兩種不同的Alexa染料標(biāo)記同樣的膜結(jié)構(gòu)，能夠在最小時(shí)間差的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)成像。你可以在兩種方法的比較中看到，在同步掃描中所有的囊泡都是黃色的——即綠色和紅色的混合物，而在序列掃描中一些快速移動(dòng)的囊泡看起來是兩種不同的結(jié)構(gòu)——即一個(gè)綠色和一個(gè)紅色的囊泡。

視頻 1：用WGA-Alexa488（綠色）、WGA-Alexa555（紅色）標(biāo)記的U2OS細(xì)胞。熒光通道是按序列成像的。你可以看到時(shí)空錯(cuò)配，這可以通過來自同一結(jié)構(gòu)的綠色和紅色信號來識別。比例尺 = 5 µm。

視頻 2：用WGA-Alexa488（綠色）、WGA-Alexa555（紅色）標(biāo)記的U2OS細(xì)胞。熒光通道是同時(shí)成像的。比例尺 = 5 µm。

中期實(shí)驗(yàn)

斑馬魚是一種模式生物，經(jīng)常用于發(fā)育研究。在這個(gè)例子中，我們感興趣的是研究細(xì)胞在空間的協(xié)調(diào)性，而這種協(xié)調(diào)性受到周圍組織的粘度的影響。在THUNDER模式下對兩個(gè)通道進(jìn)行了24小時(shí)的成像，并使用大容量成像解析（LVCC）以獲得更多的細(xì)節(jié)。

視頻 3：表達(dá)中胚層命運(yùn)報(bào)告基因的發(fā)育中的斑馬魚胚胎（Tbxta:GFP；綠色）。間質(zhì)液用Dextran-Alexa647（紅色）標(biāo)記。在超過24小時(shí)的延時(shí)拍攝中，用10x/0.32物鏡采集了25個(gè)z-層和250微米厚度的z-堆棧，時(shí)間間隔為15分鐘。使用了THUNDER 大容量成像解析（LVCC）。由Camilla Autorino提供，Petridou Group, EMBL Heidelberg（德國）。

長期實(shí)驗(yàn)

MDCK細(xì)胞是極化的上皮細(xì)胞，如果在Matrigel這樣的基質(zhì)上培養(yǎng)，會(huì)成熟為所謂的囊腫。這些三維結(jié)構(gòu)可用于研究發(fā)育過程和潛在的蛋白質(zhì)運(yùn)輸機(jī)制。這里，細(xì)胞被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了與GFP相連的微管結(jié)合蛋白，并在MICA中培養(yǎng)了3周。

圖3：MDCK囊腫。3周的活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的提取物。時(shí)間間隔為6小時(shí)。擴(kuò)展景深（EDOF）。上圖：通道疊加。中圖：EB1-GFP。下圖：寬場。THUNDER大容量成像解析（LVCC）。比例尺為20μm。圖片由德國馬爾堡菲利普斯大學(xué)的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

發(fā)育9天后，用活細(xì)胞染料對上述一些囊腫進(jìn)行了染色，以觀察肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和線粒體，此外還有GFP標(biāo)記的微管結(jié)合蛋白。隨后，在共聚焦模式下對囊腫進(jìn)行了成像。

圖4：第9天的MDCK囊腫（CLSM）。除EB1-GFP(綠色)外，部分囊腫用Mitto - blue(品紅色)、SiR-Actin(紅色)和Tubulin-SPY555(黃色)染色，并用63x/1.20物鏡在共聚焦模式下成像。比例尺 = 20 µm。圖片由德國馬爾堡菲利普斯大學(xué)的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

在U型孔板中培養(yǎng)細(xì)胞也可形成囊狀結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中，MDCK細(xì)胞從第1天開始在MICA上培養(yǎng)并在明場和寬場熒光模式下記錄，以研究囊腫的形成。MICA培養(yǎng)箱的特性使細(xì)胞在發(fā)展成囊狀結(jié)構(gòu)的過程中保持良好的狀態(tài)。

視頻 4：用10x/0.32物鏡、在GFP和明場通道下每隔30分鐘對囊腫形成進(jìn)行了三天的成像。比例尺 = 200 µm。

培養(yǎng)14天后，在低倍鏡共聚焦模式對囊腫進(jìn)行成像，以確定一個(gè)感興趣的囊腫。96孔板的情況下篩選樣本以尋找合適位置來做進(jìn)一步研究可能是很麻煩的。Navigator工具在此幫助保持樣本的預(yù)覽，并輕松地導(dǎo)航到相關(guān)的感興趣的區(qū)域。

圖5：用10x/0.32物鏡和GFP通道對第14天的囊腫進(jìn)行預(yù)覽（CLSM）。

然后用63x物鏡在LIGHTNING共聚焦模式下對其中一個(gè)囊腫進(jìn)行了更細(xì)節(jié)的成像。63x/1.20水鏡的加水是自動(dòng)建立，并通過自動(dòng)校正環(huán)對樣品進(jìn)行了優(yōu)化。視頻5顯示了在共聚焦模式下獲得的卷積和用LIGHTNING處理的卷積的對比。

視頻 5：用63x/1.20水鏡在共聚焦模式下（左）用LIGHTNING（右）拍攝的單個(gè)第14天的囊腫（CLSM）。采集了285個(gè)Z-層， 57µm厚度的Z-層，并進(jìn)行了三維重構(gòu)。

結(jié)論

MICA高度適用于快速、短期到幾周的長期活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，幫助用戶獲得可靠的結(jié)果。集成的培養(yǎng)系統(tǒng)在溫度和pH值方面提供了接近生理的條件，使活細(xì)胞成像可以持續(xù)數(shù)周。另外，可以控制氧氣水平，以獲得更高的重要數(shù)據(jù)。FluoSync™技術(shù)可以同時(shí)對多達(dá)四個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行成像，這意味著可以對快速發(fā)生的細(xì)胞事件進(jìn)行絕對的時(shí)空相關(guān)性成像。此外，F(xiàn)luoSync™縮短了記錄多色圖像之間的間隔，從而提高了時(shí)間分辨率。THUNDER和LIGHTNING幫助用戶從樣本中提取更多的細(xì)節(jié)，借助OneTouch的照明和自動(dòng)浸水的自動(dòng)化流程，即使是僅接受少量培訓(xùn)和有限技術(shù)背景的人員都可以輕松使用。

了解更多：徠卡顯微

參考資料

• Making Long-term Time-lapse Microscopy More Efficient, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

• Hadanny, A.; Efrati, S. The Hyperoxic-Hypoxic Paradox.?Biomolecules?2020,?10, 958.

• Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Molecular Motors.