【激光顯微切割小課堂】激光顯微切割實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的RNA提取

由于自身的不穩(wěn)定性，RNA通常比DNA更難處理。RNA并不具備DNA穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。為了在處理RNA時(shí)保證優(yōu)良品質(zhì)，必須從優(yōu)質(zhì)材料開(kāi)始，并在處理前后進(jìn)行特別仔細(xì)的質(zhì)量控制。所謂的RNA完整性指數(shù)（RIN）是RNA質(zhì)量的指標(biāo)^[1]。根據(jù)1到10的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，RIN值為1表示RNA已wanquan分解，RIN值為10則表示RNA完好無(wú)損。簡(jiǎn)言之，RIN數(shù)值越高，RNA質(zhì)量越高。只要可能，應(yīng)始終選用具有高RIN值的材料。

固定并染色樣品制備方法的影響以及后續(xù)紫外激光顯微切片對(duì)于小鼠腦組織切片（事后檢查）的影響描述如下。將冷凍保存且未經(jīng)處理的腦組織切片的RIN值與采用標(biāo)準(zhǔn)方案處理并分離的切片進(jìn)行比較。圖1顯示了從冷凍切片到RIN分析的樣品制備工作流程。

為了比較未經(jīng)處理的組織樣本與固定和染色的組織樣本，使用3組已知RIN完整指數(shù)（RIN）的冷凍保存小鼠腦組織。在-80°C冷凍保存后，將它們轉(zhuǎn)移到冷凍切片刀處，并在-35°C下孵育45分鐘，然后將組織在-18°C下平衡30分鐘，接著在-18°C下通過(guò)冷凍切片將其切成12µm的切片。小鼠腦組織切片分為兩組，并按以下方式處理。一個(gè)是對(duì)照組，直接冷凍在-80°C，另一組則進(jìn)行無(wú)RNase的紫外線處理PEN載玻片。這需要通過(guò)在室溫下短暫解凍切片并在冷卻至-20°C的75%乙醇溶液中固定2分鐘來(lái)，然后，立即用幾滴無(wú)菌過(guò)濾的甲酚紫(CV)染料溶液(含5%甲酚紫的純乙醇溶液)并輕輕來(lái)回移動(dòng)孵育45秒。

在染色過(guò)程中，染料溶液會(huì)短暫排除，載玻片浸入一系列濃度遞增（75%、95%和100%）的乙醇溶液中，每次4秒鐘，最后固定在100%的乙醇溶液中（試驗(yàn)組）。完成固定和染色程序之后，將載玻片在裝有硅凝膠的干燥室中放置45分鐘，然后保存在-80°C的干燥箱中，等待進(jìn)行激光顯微切片。

固定和染色之后，相關(guān)組織采用溫和且無(wú)污染的紫外激光顯微切片（UV LMD）進(jìn)行分離^[2]。這需要使用顯微鏡的10倍物鏡對(duì)組織進(jìn)行標(biāo)記并分割成多個(gè)矩形，然后使用足夠能量的激光束通過(guò)“Draw + Cut"（繪圖切割）模式進(jìn)行wanquan消融。切割物收集在0.5ml的無(wú)RNase蓋帽中，以便對(duì)RNA內(nèi)容進(jìn)行提純。這些會(huì)保存在–80°C的環(huán)境下，等待進(jìn)行RNA分離。

兩組樣品，即保存在在 –80°C下未經(jīng)處理的樣品，以及經(jīng)固定、染色和激光顯微切片處理的樣品，接受平行解凍并同時(shí)用相同的試劑處理。按照制造商的說(shuō)明使用Qiagen的RNase Mini Kit^®進(jìn)行提純。提純的RNA使用30µl的無(wú)RNase水洗脫到新的無(wú)RNase試管中。

為了比較天然冷凍組織切片與經(jīng)過(guò)CV染色、乙醇固定、激光顯微切割的組織切片的RNA質(zhì)量，將來(lái)自每個(gè)不同處理樣品的RNA放入同一RNA納米芯片（安捷倫生物分析儀）。RNA納米芯片通過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳分離RNA樣品，并根據(jù)樣品在芯片上的移動(dòng)方式對(duì)樣品質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)。如前所述，RNA質(zhì)量表示為RIN值，其中10表示wanquan完整的RNA，1表示wanquan分解的RNA。

此處進(jìn)行的RIN分析（圖2中的樣品測(cè)量）表明，來(lái)自直接冷凍的天然組織的RNA樣品的RIN值與根據(jù)UV-LMD標(biāo)準(zhǔn)方案處理的RNA樣品的RIN值沒(méi)有太大差異。

緊接著將分離的RNA樣品分成兩組，每組中有一半的樣品進(jìn)行沉淀。在RNA沉淀后，根據(jù)參考文件3中提供的說(shuō)明，來(lái)自天然冷凍組織的已沉淀樣品的RNA的RIN值略低于來(lái)自經(jīng)過(guò)CV染色、EtOH固定、UV-LMD處理的樣品的RNA的RIN值^[3]。這種差異可能來(lái)自沉淀混合物的poly-I，因?yàn)槠渲幸恍┒替淩NA分子在芯片中進(jìn)行RIN測(cè)量時(shí)會(huì)被提純并與其他RNA一起檢測(cè)，并計(jì)入分解部分。在qPCR 反應(yīng)中，poly-I沒(méi)有產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，經(jīng)過(guò)固定、染色以及紫外激光顯微切片的腦組織切片有沒(méi)有進(jìn)行RNA沉淀，都不會(huì)影響其質(zhì)量。圖2顯示了未經(jīng)處理的天然小鼠腦組織切片和經(jīng)過(guò)固定并染色的小鼠腦組織切片在RNA質(zhì)量方面的比較結(jié)果