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對小鼠整個視網(wǎng)膜進(jìn)行快速、清晰的高對比度成像，以研究內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。
本文描述通過使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）技術(shù)高效地研究小鼠視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。視網(wǎng)膜血管疾病一般是視力受損的主要原因?；蛲蛔儠?dǎo)致人體視網(wǎng)膜血管發(fā)生改變，進(jìn)而引發(fā)家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）、諾里病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）或Coats病。
視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用可使用小鼠視網(wǎng)膜模型來進(jìn)行研究。通過整個視網(wǎng)膜制樣和高分辨率熒光成像可觀察視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞相互作用的信息。
簡介
視網(wǎng)膜血管疾病是導(dǎo)致視力受損和失明的主因[1]。大多數(shù)哺乳動物的視網(wǎng)膜由三層血管網(wǎng)絡(luò)形成，其中包括兩個視網(wǎng)膜內(nèi)毛細(xì)血管床。在人體內(nèi)，基因突變會引發(fā)家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）、以及周邊視網(wǎng)膜血管化不完整為特征的遺傳性疾病、如諾里病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）或Coats病[1]?；加羞@些疾病的視網(wǎng)膜血管都有所改變?？茖W(xué)家利用小鼠視網(wǎng)膜模型來研究視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用。利用整個視網(wǎng)膜制片來展示視網(wǎng)膜血管[1]。固定并染色后，必須對整個視網(wǎng)膜進(jìn)行高分辨率成像，以觀察整個血管網(wǎng)絡(luò)及單細(xì)胞相互作用。本文將展示如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）高效地研究小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞間的相互作用[2，3]。
挑戰(zhàn)
如何對整個視網(wǎng)膜進(jìn)行快速成像，并獲得清晰的高對比度3D成像結(jié)果，展示重要細(xì)節(jié)對研究視網(wǎng)膜至關(guān)重要。視網(wǎng)膜成像一般使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描，但是這種方法要花費數(shù)小時才能采集到整個視網(wǎng)膜圖像。而常規(guī)的寬場顯微雖然成像速度快，檢測靈敏度高，但是對厚標(biāo)本的成像，如整個視網(wǎng)膜，通常會出現(xiàn)非焦平面干擾導(dǎo)致模糊，降低對比度[2，3]。
方法
使用THUNDER Imager 3D Cell Culture儀器對整個視網(wǎng)膜進(jìn)行成像。使用抗CD31抗體標(biāo)記視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（黃色），使用IsoB4標(biāo)記視網(wǎng)膜血管和小膠質(zhì)細(xì)胞（品紅色），并使用抗GFAP抗體標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞（青色）。觀察整個視網(wǎng)膜時，采用3個熒光通道，用20x Plan Apo 0.8 NA（數(shù)值孔徑）物鏡和100個視野拼接、厚度為15-μm進(jìn)行 Z軸堆棧成像。
結(jié)果
Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2，3]方法可清晰展示視網(wǎng)膜內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞間的相互作用（見圖1）。一般情況下，通過寬場顯微鏡很難觀察到視網(wǎng)膜中的這些細(xì)胞。通過THUNDER Imager 3D Cell Culture進(jìn)行高速采集，可在幾分鐘時間內(nèi)采集到大約24 GB的整個視網(wǎng)膜成像。采用LAS X Navigator軟件中焦平面矯正的方法，可以保證視網(wǎng)膜樣本每一個位置都處于最佳焦平面。
圖1：使用THUNDER Imager 3D Cell Culture整個視網(wǎng)膜制片的zui大化投影圖像：A) 寬場原始數(shù)據(jù)和 B) LVCC結(jié)果。插圖所示為單個內(nèi)皮細(xì)胞（黃色， CD31抗體）、血管和小膠質(zhì)細(xì)胞（品紅色，IsoB4）和星形細(xì)胞（青色， GFAP抗體）的寬場視圖。圖片來源：Jiyeon Lee博士和Jeremy Burton博士，Roche Genentech，美國加利福尼亞州南舊金山。
結(jié)論
THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2，3]與傳統(tǒng)寬場成像相比，對整個小鼠視網(wǎng)膜成像時會顯著增強(qiáng)對比度，可以高效地研究內(nèi)皮細(xì)胞、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞間的相互作用。
References：
1.H.J. Junge, S. Yang, J.B. Burton, K. Paes, X. Shu, D.M. French, M. Costa, D.S. Rice, W. Ye, TSPAN12 Regulates Retinal Vascular Development by Promoting Norrin- but Not Wnt-Induced FZD4/β-Catenin Signaling, Cell (2009) vol. 139, iss. 2, pp. 299-311, DOI: 10.1016/j.cell.2009.07.048.
2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
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