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自發(fā)熒光不ok?染料pick不自由?徠卡TauSense技術(shù)來幫您

更新時間:2020-07-03      點擊次數(shù):2037

徠卡顯微系統(tǒng) 王浩甲

熒光顯微成像技術(shù)對生命科學(xué)的研究起到了巨大的推進作用,但自發(fā)熒光信號往往會對成像結(jié)果造成非常大的干擾(圖1)。常規(guī)的解決方法主要是通過改進制樣流程和調(diào)節(jié)成像參數(shù)來進行優(yōu)化,但這些方法只能起到部分的改善作用,并不能*去除自發(fā)熒光信號。對于這個實驗路上的絆腳石難道真的就沒有辦法了嗎?當(dāng)然不是,接下來就為您介紹自發(fā)熒光的克星——熒光壽命。

1.鈴蘭莖自發(fā)熒光

 熒光分子受到特定激光激發(fā)后,從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),再以輻射躍遷的形式發(fā)出熒光并回到基態(tài),熒光分子停留在激發(fā)態(tài)的時間就叫做熒光壽命(圖2。如果自發(fā)熒光和我們用來標(biāo)記樣本的熒光基團的壽命存在較大的差異,通過調(diào)節(jié)熒光壽命檢測范圍,就可以避免這些干擾信號的接收了。

2.熒光激發(fā)示意圖

 從激發(fā)光開始照射樣品到檢測器探測到光子的這段時間稱作光子到達(dá)時間。樣品的熒光壽命光子到達(dá)時間呈正相關(guān),而一個像素點中包含多個光子,多個光子到達(dá)時間的平均值(Average Arrival Time, AAT)就可以反映該像素點的熒光壽命信息。

徠卡全新推出的帶有白激光的STELLARIS系列激光共聚焦顯微鏡(圖3)配備了基于AAT檢測技術(shù)的TauSense模塊,它包含三大項功能,對您的實驗大有裨益,大家一起來認(rèn)識一下吧!

 3. STELLARIS

  • TauGating

獲得高質(zhì)量的熒光圖像是成像實驗基本的需求,但背景噪音、自發(fā)熒光、反射光、雜散光等等頑固分子一次次地挑戰(zhàn)著我們的耐心,而使用TauGating即可一鍵式去除這些干擾因素。

TauGating操作非常簡單,如圖4,點擊“+”“-”即可靈活修改通道數(shù),可設(shè)置多達(dá)16個通道,每個通道的時間檢測范圍均可獨立調(diào)節(jié)。一般來說,上述干擾因素的AAT和熒光信號的AAT存在差異,通過調(diào)節(jié)時間檢測范圍即可避開對干擾因素的接收,獲得真實的熒光信號。

 

4. TauGating操作界面

從圖5可以看到,和常規(guī)共聚焦成像相比,TauGating消除了背景雜散光,圖像的對比度和信噪比得到了極大的提升。

5. TauGating與常規(guī)共聚焦成像效果對比

  • TauSeparation

在實驗設(shè)計階段,熒光基團的選擇是一件非常重要且復(fù)雜的事情,不僅要考慮到各種繁雜的光譜組合來避免通道之間的串色,還要考慮使用和共聚焦固定激發(fā)譜線相匹配的染料。如此一來,留給我們的選擇往往就會很少,如果樣本中有自發(fā)熒光,染料選擇就更加受限了。針對這項問題,TauSeparation可以為您提供*的解決方案。

 

6. NE-115細(xì)胞4色熒光成像

多色染料拆分

6中,NE-115細(xì)胞同時標(biāo)記了LifeAct-mNeonGreenMitotracker Green、 NuC Red SiR-tubulin4種熒光染料,但由于LifeAct-mNeonGreen Mitotracker Green的發(fā)射光譜高度重疊,NuC Red SiR-tubulin的發(fā)射光譜高度重疊,所以在用常規(guī)共聚焦(左圖)拍攝時只能體現(xiàn)出兩種信號的差異。而在TauSeparation模式下(右圖),通過檢測AAT,我們使用一個檢測器就可以同時將這兩種發(fā)射光譜重疊的染料區(qū)分出來(LifeAct-mNeonGreen-紅色,Mitotracker Green-綠色,Nuc Red–青色,SiR-tubulin品紅色),所以只需要使用兩個檢測器,就可以得到這幅沒有串色的4色熒光圖像了。

 

 

7. 植物組織自發(fā)熒光檢測

自發(fā)熒光拆分

對于自發(fā)熒光的拆分,TauSeparation同樣得心應(yīng)手。例如圖7左側(cè)的常規(guī)熒光強度圖像,熒光信號和背景自發(fā)熒光沒有區(qū)別;右側(cè)的圖像在TauSeparation模式下,葉綠體中的自發(fā)熒光(藍(lán)色)與來自細(xì)胞膜的目標(biāo)熒光信號(綠色)就可以非常清楚地區(qū)分開了,是不是很簡便呢?

  • TauContrast

當(dāng)您選擇在TauContrast模式下成像時,不但可以獲取常規(guī)的熒光強度圖像,還可以通過AAT獲取分子的代謝狀態(tài)、pH值和離子濃度等功能信息,充分挖掘出樣本潛在信息。例如圖8Ca2+濃度會影響熒光基團Oregon Green 的熒光壽命,通過TauContrast可以實時獲取Oregon GreenAAT,從而反映各框選區(qū)域(ROI)的Ca2+濃度隨時間的變化水平。

8. 機械刺激后對標(biāo)記了Oregon Green 488的哺乳動物細(xì)胞鈣振蕩進行檢測。在TauContrast模式下通過檢測AAT的變化來記錄單個細(xì)胞對機械刺激的響應(yīng)情況。以4.5fps的拍攝速率記錄了AAT在不同框選區(qū)域的變化軌跡(用不同顏色選擇的ROI)。圖像尺寸:256 × 256 pixels;Rainbow LUT (TauContrast): 0-4 ns.

 

通過白激光和AOBS,徠卡*實現(xiàn)了激發(fā)光選擇自由;

通過棱鏡分光和狹縫檢測技術(shù),徠卡*實現(xiàn)了所有檢測器的全光譜檢測自由;

這一次,通過TauSense技術(shù),不僅*排除了自發(fā)熒光干擾,染料選擇也更加自由。

 

沒有自發(fā)熒光的干擾,全流程的選擇自由,讓您可以任意pick熒光染料和熒光蛋白,讓您的idea不再受到硬件設(shè)施的限制。STELLARIS能給您帶來的好處遠(yuǎn)不止于此,歡迎您關(guān)注我們的公眾號,我們將持續(xù)為您帶來更多更詳盡的的講解。科研路漫漫,愿STELLARIS助您的科研之舟乘風(fēng)破浪,揚帆遠(yuǎn)航!

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