Cell：SP8 STED 納米顯微鏡對人瘧疾感染初期關鍵蛋白的鑒定

瘧疾是一種威脅生命的疾病，通過被原生動物寄生蟲感染的蚊子叮咬傳播。常見和危險的瘧疾類型是惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）引起的瘧疾。瘧疾引起了嚴重關切，因為世界上有一半的人口處于這種危險之中，而且迄今為止還沒有有效疫苗。2016年，世界衛(wèi)生組織報告了2.16億例[1]，其中50萬人死亡，由瘧疾造成的經濟負擔超過了數(shù)十億美元。

圖1. 瘧原蟲對紅細胞的侵襲示意圖

在細胞水平，惡性瘧原蟲對紅細胞的感染引發(fā)了該疾病的臨床癥狀。該階段涉及高度動態(tài)的蛋白質間的相互作用，由于它們的復雜性，目前仍然知之甚少。澳大利亞墨爾本大學Cowman等利用SP8 STED納米顯微鏡和特定蛋白的條件表達，確定了在入侵階段的關鍵蛋白復合物。形成復合物的蛋白質能夠使宿主-病原體相連接，并且復合物的存在是宿主-病原體緊密連接和紅細胞Ca2+釋放所必需的（圖1）。這一突破發(fā)表在Cell Host＆Microbe雜志上[2]。

瘧疾感染的主要參與者

圖2：瘧原蟲生命周期的三個主要階段：肝臟階段，血液階段和載體階段。綠色圓圈顯示寄生蟲從載體到宿主、從宿主到載體的關鍵入口點。圖片來源[3]。

進入人類宿主后，隨著瘧疾的發(fā)展，瘧原寄生蟲在其生命周期中以不同的形式存在（圖2）。在所謂的血液階段[4]，以裂殖子形式存在于紅細胞，通過不同階段進化，感染的宿主細胞中會產生約30個子代裂殖子，并準備入侵其他細胞。裂殖子入侵是寄生蟲在血流中傳播和疾病發(fā)作的關鍵。盡管如此，該疾病的分子機制尚不清楚。

為了侵入紅細胞，裂殖子必須首先與宿主細胞接觸，即所謂的“入侵前”階段[5]，使紅細胞膜變形，裂殖子配體與膜中的特定受體結合，形成緊密連接，并觸發(fā)Ca2+流。Ca2+的流動似乎對細胞侵襲很重要。寄生蟲與細胞的附著變得不可逆轉，并在不到2分鐘內進入紅細胞。

惡性瘧原蟲紅細胞結合蛋白同源物（PfRh）和紅細胞結合類蛋白是參與入侵的重要信號[6]。PfRh家族的關鍵成員是PfRh5，其與宿主蛋白受體basigin結合可以誘導Ca2+釋放到紅細胞中，并標志著裂殖子和血細胞膜的橋連通道的形成。PfRh5對于裂殖子侵入至關重要，正如抗體或可溶性basigin抑制紅細胞感染的研究所示[7]。PfRh5與PfRh5相互作用蛋白（PfRipr）和富含半胱氨酸的保護性抗原（CyRPA）一起發(fā)揮作用，但這種相互作用的功能尚不清楚。了解PfRh5/PfRipr/CyRPA的作用非常重要，因為這些蛋白質是開發(fā)抑制血液中瘧疾發(fā)展的疫苗的重要候選者[8]。

用正確的工具尋找瘧疾感染的答案

視頻1 PfRipr缺失的裂殖子試圖感染紅細胞

Cowman等開展了轉基因惡性瘧原蟲系的研究工作，分別敲除PfRipr和CyRPA的基因，RiprloxCre和CyRPAloxCre[2]。在含有RiprloxCre和CyRPAloxCre基因的寄生蟲加入重組酶（雷帕霉素誘導的DiCre）以快速且非常有效地調節(jié)基因缺失，從而相應地控制兩種蛋白質水平。作者還進行了活細胞成像，并確認PfRipr和CyRPA在與宿主細胞初次接觸后對紅細胞侵襲至關重要。在沒有PfRipr或CyRPA的情況下，宿主細胞膜仍然變形，但缺乏Ca2+流動，因此寄生蟲不能進入血細胞（視頻1）。

SP8 STED納米顯微鏡發(fā)現(xiàn)未知

接下來，Cowman等研究了入侵期間的PfRh5、PfRipr和CyRPA的定位[2]。共聚焦成像顯示三種蛋白質在寄生蟲頂端優(yōu)先定位，該區(qū)域優(yōu)先與宿主細胞接觸。然而，對于生物分子的空間分布的評估只可能發(fā)生于低于顯微成像3/4衍射極限的分辨率水平上，2D通常低于30nm、3D STED（受激發(fā)射損耗）通常低于100nm。為此，將紅細胞與裂殖子一起孵育以誘導入侵并用抗體探針對靶蛋白進行標記。樣品被放置于Leica TCS SP8 STED納米顯微鏡上進行2D和3D超高分辨成像（775nm，視頻2）。為了進一步確定入侵的初始階段，研究人員還對RON4進行了免疫熒光標記，RON4是定位于寄生蟲頂端的蛋白質（圖3）。

圖3：侵入紅細胞的裂殖子的STED納米檢測。3D STED圖像顯示RON4（品紅色）與蛋白質PfRh5（上圖左，綠色）、PfRipr（中，綠色）、PfCyRPA（右，綠色）的疊加。DAPI核染色顯示為藍色，紅細胞膜顯示為灰色。比例尺為1μm。圖片由Walter和Eliza Hall醫(yī)學研究Alan Cowman教授。

視頻2 裂殖子入侵紅細胞早期的STED 3D構建

用SP8 STED獲得的空間信息顯示PfRh5、PfRipr和CyRPA在寄生蟲頂端進行共定位，其中也發(fā)現(xiàn)了RON4的存在（視頻2）。單個蛋白質和PfRh5/PfRipr和CyRPA/PfRipr二聚體復合物在裂殖子膜上表現(xiàn)出拼接分布，與頂端末端的釋放一致。使用2D STED進行更近、更高分辨率的成像證實PfRipr和CyRPA在裂殖子上擴散，但特別局限于頂端。對PfRh5/PfRipr和CyRPA/PfRipr的共定位程度的評估顯示，PfRh5/PfRipr的比例更大。該發(fā)現(xiàn)表明CyRPA/PfRipr擴散到裂殖子表面上，隨后PfRh5/CyRPA/PfRipR復合物直接在表面頂端聚集以結合basigin，然后觸發(fā)緊密連接的形成，并進入入侵感染的下一步。單個PfRh5、PfRipr和CyRPA的出現(xiàn)也表明，每種蛋白質仍可用于合成復合物。

圖3：PfRipr在侵入紅細胞的裂殖子上的定位。用WGA（綠色）染色的紅細胞膜。左為共聚焦圖像，使用2D STED（MIP）可視化PfRipr。DAPI（藍色）。白條表示1μm。

展望

對紅細胞的侵入是人類宿主中瘧疾感染的關鍵階段。直到近，對所涉及的蛋白質的相互作用和功能的研究是有限的，因為關鍵配體PfRh5的抑制*抑制感染的的入侵。使用PfRipr和CyRPA的條件表達和STED納米顯微成像，Cowman等揭示了PfRipr、CyRPA和PfRh5/PfRipr/CyRPA復合物在裂殖子入侵中的重要作用[2]。通過復合物與宿主受體basigin的結合，蛋白質參與Ca2+釋放到紅細胞中。SP8 STED納米顯微鏡提供了必要的分辨率，以顯示PfRh5/PfRipr/CyRPA復合物在寄生蟲和宿主細胞之間界面處的形成。以前的研究表明，CyRPA將復合物與寄生蟲膜相連[8]，但Cowman組進行了額外的生化分析，結果顯示情況并非如此。相反，結果表明其他蛋白質必須將復合物錨定到宿主細胞并指導它在頂端的形成。

未來的工作將有助于找到參與裂殖子/宿主細胞相互作用的新蛋白質，并了解Ca2+釋放在感染途徑中的功能作用。終，解剖宿主和病原體之間的相互作用將有助于找到更有效的方法來對抗瘧疾。

參考文獻

1. World Health Organization (WHO), World Malaria Report 2017 (WHO, Geneva, Switzerland, 29 November 2017)

2. Volz JC, Yap A, et al. (2016) Essential Role of the PfRh5/PfRipr/CyRPA Complex during Plasmodium falciparum Invasion of Erythrocytes, Cell Host Microbe 20 (1), 60-71, DOI: 10.1016/j.chom.2016.06.004

3. Delves M, Plouffe D, et al. (2012) The Activities of Current Antimalarial Drugs on the Life Cycle Stages of Plasmodium: A Comparative Study with Human and Rodent Parasites. PLoS Med 9(2): e1001169. DOI:10.1371/journal.pmed.1001169

4. Cowman, A.F., Crabb, B.S. (2006) Invasion of red blood cells by malaria parasites, Cell 124, 755–766, DOI: 10.1016/j.cell.2006.02.006

5. Weiss GE, Gilson PR, et al. (2015) Revealing the sequence and resulting cellular morphology of receptor-ligand interactions during Plasmodium falciparum invasion of erythrocytes. PLoS Pathog 11 (2), e1004670, DOI:      10.1371/journal.ppat.1004670

6. Tham WH, Healer J, et al. (2012) Erythrocyte and reticulocyte binding-like proteins of Plasmodium falciparum. Trends Parasitol 28 (1), 23–30, DOI: 10.1016/j.pt.2011.10.002

7. Chen L, Lopaticki S, et al. (2011) An EGF-like protein forms a complex with PfRh5 and is required for invasion of human erythrocytes by Plasmodium falciparum. PLoS Pathog 7 (9), e1002199, DOI: 10.1371/journal.ppat.1002199

8. Douglas AD, Baldeviano GC, et al. (2015) A PfRH5-based vaccine is efficacious against heterologous strain blood-stage Plasmodium falciparum infection in Aotusmonkeys, Cell Host Microbe 17 (1), 130–139,

DOI: 10.1016/j.chom.2014.11.017

9. Reddy KS, Amlabu E, et al. (2015) Multiprotein complex between the GPI-anchored CyRPA with PfRH5 and PfRipr is crucial for Plasmodium falciparum erythrocyte invasion, Proc. Natl Acad Sci USA 112 (4), 1179–1184,

DOI: 10.1073/pnas.1415466112